Tecniche di osservazioni in microscopia ottica - Prima parte

Per ottimizzare l’osservazione al microscopio ottico esistono diverse metodiche che sono legate fondamentalmente alla natura del campione e alla sua preparazione per essere esaminato al microscopio.
Queste metodiche si concentrano prevalentemente sul sistema di illuminazione che permette di investigare perfettamente il campione.

In generale esistono diverse tipologie di preparato con caratteristiche sia di natura sia di supporto per il microscopio.

Preparato colorato. Fissato su vetrino.
- Istologia, citologia, ematologia, sezioni sottili (trasparenti) di materiali, petrografia (trasparenti).
Preparato non colorato. Fissato su vetrino.
- Fibre d’amianto, sezioni biologiche non colorabili, tessuto nervoso, microrganismi, batteri.
Preparati in vivo, colture cellulari, microorganismi. Generalmente questi campioni sono contenuti in appositi supporti, piastre, fiasche e vengono osservati con il microscopio di tipo rovesciato.
Preparati colorati con opportuni coloranti fluorescenti sia fissati che in vivo.

Ognuna di queste categorie ha una sua specifica applicazione e metodica di illuminazione.

CAMPO CHIARO

Preparato colorato. Fissato su vetrino.

È la metodica più diffusa. Il preparato colorato con opportune tecniche viene illuminato con luce bianca. L’illuminazione trasmessa che attraversa il preparato modifica la natura cromatica della luce e mette in risalto la colorazione del preparato. Generalmente questa metodica viene utilizzata con microscopi dritti.

La luce bianca generata o da una lampada alogena o più frequentemente oggi da un LED, viene fatta convergere sul preparato utilizzando un sistema ottico chiamato condensatore che ottimizza l’omogeneità di illuminazione sul preparato.

CAMPO SCURO

Preparato non colorato.

La risoluzione, ossia la capacità di distinguere due oggetti adiacenti come distinti e separati, è molto maggiore nella microscopia in campo oscuro di quella rilevabile nelle tecniche di microscopia a fondo chiaro. Per questo motivo questa tecnica fu chiamata “ultra microscopio”. In pratica si utilizza un particolare condensatore che non permette l’illuminazione diretta del preparato.

Il preparato farà deviare la luce che quindi sarà visibile all’osservatore. Tipicamente l’immagine che si ottiene sarà su campo scuro con una forte evidenza dei bordi del campione.
La microscopia in campo scuro è particolarmente utile per osservare microrganismi, batteri, diatomee, sedimenti, urine. In generale usato sui microscopi dritti il campo scuro utilizza condensatori dedicati a questa tecnica.

CONTRASTO DI FASE

Preparato non colorato. Preparati in vivo, colture cellulari.

Inventato nel 1932 da Zernicke, sfrutta le differenze di indice di rifrazione e di spessore tra il campione e la zona circostante non occupata.

Permette l’osservazione di campioni non colorati e di spessore estremamente piccolo, che in campo chiaro non sarebbero osservabili. A differenza del Campo Scuro questa tecnica permette una osservazione più accurata anche della morfologia delle porzioni interne del campione.

Il microscopio deve essere dotato di un particolare condensatore capace di accettare dei diaframmi, “anelli di fase”, centrabili rispetto all’asse ottico. Si devono utilizzare anche specifici obiettivi per Contrasto di Fase (Ph) che hanno al loro interno un diaframma che verrò allineato agli anelli di fase presenti nel condensatore.
I campioni non colorati o non colorabili come le colture cellulari in vivo estremamente sottili e molto trasparenti non riescono ad “assorbire” la luce per creare differenze nella distribuzione dell’intensità nell’immagine. Pertanto, in un microscopio a campo chiaro, il campione non viene visualizzato chiaramente.

Ma come funziona questa metodica? Utilizzando gli anelli di fase del condensatore che sono coniugati otticamente a quelli presenti negli obiettivi, alcuni raggi di luce deviati a causa della variazione di densità e indice di rifrazione all’interno del campione e vengono ritardati di 1/4 della lunghezza d’onda. La luce deviata viene focalizzata per formare un’immagine dell’oggetto. Quelli non deviati colpiscono l’anello di fase dell’obiettivo, mentre i raggi deviati mancano l’anello e passano senza essere intercettati. La luce non deviata che colpisce l’anello di fase avanza di 1/4 di lunghezza d’onda quando passa attraverso questo anello. Le onde deviate e non deviate diventano a 1/2 lunghezza d’onda l’una rispetto all’altra e si annulleranno a vicenda per unirsi per formare un’immagine. Quindi luci deviate e non deviate formeranno un’immagine visibile. Lo sfondo formato dalla luce non deviata è luminoso mentre l’oggetto non colorato appare ben definito.

Altre metodiche

Esistono altre metodiche importanti: Fluorescenza, DIC Differential Interference Contrast, Hoffman Modulation Contrast, Polarizzazione.

Affronteremo queste metodiche nel prossimo capitolo sulle metodiche di osservazione.

Come scegliere la giusta applicazione per i vostri campioni? Per questo vi invitiamo a contattarci per approfondire la scelta del microscopio, degli obiettivi o per definire un setup specifico per le vostre applicazioni.
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